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E.coli Poly(A)聚合酶能以不依赖于模板的方式催化由ATP转化成的AMP添加到单链RNA的3’末端，以形成Poly(A)尾。E.coli Poly(A)聚合酶能以各种单链RNA作为底物RNA，但双链RNA及过短的寡核苷酸不推荐作为该反应的RNA底物，并且DNA不能作为该反应的底物。实测15nt合成的RNA完全可以作为E.coli Poly(A) Polymerase的底物，在ATP存在时催化形成Poly(A)尾的。E.coli Poly(A) Polymerase催化的Poly(A)加尾反应只能使用ATP，而不能使用ADP或dATP。另外，使用CTP和UTP时，其掺入量不足使用ATP时的5%；而使用GTP时，其完全不能添加到RNA的3'末端。

图1.本制品与N公司的同类产品对单链RNA加Poly(A)尾的对比效果图。在20μL反应体系(50mM Tris-HCl,pH8.1,250mM NaCl,1mM ATP,10mM MgCl₂)中，加入人工合成的0.5μg 22nt的单链RNA，以及图中指定量的本制品或N公司的E.coli Poly(A) Polymerase，37℃孵育30min，65℃孵育20min终止反应。取出5μL反应后的产物，加入1μL 6×DNA上样缓冲液，95℃变性3min，然后进行含7M Urea的15%聚丙烯酰胺凝胶电泳。室温条件下用1×TBE作为电泳液，180V电泳90min，NadRed红色核酸染料1:1000稀释后室温染色30min，然后拍照观察。如图所示，本制品与N公司的产品相比，具有类似的对单链RNA加Poly(A)尾的效果。


用放射性同位素标记的ATP或虫草素(cordycepin)标记RNA；为RNA添加Poly(A)尾，用于反转录后克隆或亲和纯化；增加mRNA的稳定性，从而提高转染至真核细胞中的RNA的翻译效率。


重组E.coli菌株，携带克隆自大肠杆菌的Poly(A)聚合酶基因。


一个单位是指在20μL反应体系中，37℃条件下，10分钟内将1nmol AMP以掺入到RNA中所需的酶量。

组分	100U	500U	2500U	10kU
E.coli Poly(A)聚合酶(5U/μL)	20μL	100μL	500μL	2mL
10×PAP Reaction Buffer	50μL	250μL	1.25mL	5mL
10mM ATP	50μL	250μL	1.25mL	5mL

保存：-20℃，有效期2年。


20mM Tris-HCl(pH7.5@25℃)，500mM NaCl，1mM DTT，1mM EDTA，50% (v/v) Glycerol，0.1%(w/v) Triton X-100。


10×PAP Reaction Buffer：
500mM Tris-HCl(pH8.1@25℃)，2.5M NaCl，100mM MgCl₂。


不含DNase、RNase和磷酸酯酶。


加入EDTA至终浓度为10mM，或65℃加热20min。

• 反应缓冲液PAP Reaction Buffer中不包含ATP。
  
• E.coli Poly(A)聚合酶的用量主要影响目的产物的长度，可以根据所需目的产物的长度适当调整酶的用量，如果想得到长度较长的产物可以适当加大酶的用量或延长反应时间。

• 参考下表在冰浴中设置反应体系。参考下表20μL反应体系中加Poly(A)尾的RNA底物量可以高达10μg，并且可根据实验需要按比例放大反应体系。在Poly(A)加尾反应中，加尾的长度取决于RNA 3'-OH末端的摩尔浓度、反应时间、酶量和ATP浓度。可以通过更改一个或多个因素来调整加尾的长度。按照如下的推荐反应体系，在37℃孵育30min，加Poly(A)尾长度可以超过100个碱基。
  

  成分	用量	终浓度
  DEPC-treated Water	(14.5-x)μL	-
  10×PAP Reaction Buffer	2μL	1×
  10mM ATP	2μL	1mM
  RNase Inhibitor(40U/μL)	0.5μL	1U/μL(可选)
  RNA	xμl	0.05～0.5μg/μL
  E.coli Poly(A)聚合酶(5U/μL)	1μL	0.25U/μL
  总体积	20μL	-

  • 由于涉及RNA操作，需要严格按照RNA操作的规范进行，避免RNase污染，相关试剂和耗材需要经过DEPC处理以去除RNase或者确保是RNase free的。
    
  • 用于加尾反应的RNA在使用前应进行适当的纯化，并溶解于nuclease free water中，且溶液中应不含EDTA和盐分。
    
  • 如果较难确保比较严格的RNase-free，推荐在上述反应体系中添加0.5μL RNase抑制剂，以提高溶液中RNA的稳定性。
• 加尾反应：37℃孵育30min。
  
• 反应终止：加入EDTA至终浓度为10mM，或65℃加热20min以终止反应。

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